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流式检测服务

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  流式细胞术目前主要用于检测样本中所发出的荧光强度,分析细胞表面和细胞内分子表达水平,从多样性的细胞群中分辨及界定不同细胞种类,测定分离出的细胞亚群纯度,以及分析细胞的大小和总量。它可以同时分析单个细胞的多个参数。


原理


正常活细胞中,磷脂酰丝氨酸(PS)仅分布于细胞磷脂双分子层内侧,凋亡早期,磷脂酰丝氨酸(PS)由细胞膜内侧翻向细胞膜外侧,可作为凋亡细胞表面的特异性标记靶标。

而广泛存在于真核细胞胞浆内的一种 Ca+依赖的磷脂结合蛋白——Annexin V(一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白,分子量为 35-36KDa),可特异性高亲和结合磷脂酰丝氨酸(PS),荧光标记的 Annexin V仍可与磷脂酰丝氨酸(PS)高亲和结合,作为特异性荧光探针用于标记凋亡早期的细胞。      


有研究发现核酸荧光染料碘化丙啶 (Propidium lodied,PI),不能透过正常活细胞和凋亡早期具有完整细胞膜结构的细胞,但可穿透细胞膜损伤的细胞(如坏死或凋亡晚期的细胞),嵌入双链 DNA,水溶液中,与 DNA 结合的该染料最大激发/发射波长为 535/617 nm。


利用该特性,通常与荧光标记的 Annexin V——FITC-Annexin V 结合利用流式细胞仪或荧光显微镜对凋亡细胞进行分群。


另外,红色核酸染料 7-AAD 也可穿透细胞膜损伤的细胞,与荧光标记的 Annexin V——PE-Annexin V 结合利用流式细胞仪或荧光显微镜对凋亡细胞进行分群。


用途


1、精确反应细胞群体的凋亡趋势;

2、对细胞中凋亡细胞进行分群和定量;

3、对凋亡细胞进行分群和定量


材料与仪器


1、孵育缓冲液:10 mmol/L HEPES/NaOH,PH 7.4,140 mmol/L NaCl,5 mmol/L CaCl2

2、标记液:将FITC- Annexin V 和PI加入到孵育缓冲液中,终浓度均为1ug/ml

3、流式细胞仪


步骤


1、细胞收集:悬浮或贴壁细胞(无 EDTA 胰酶消化)收集到离心管中,300-500 g 离心5 min,弃去培养液;

2、用 PBS 洗涤细胞两次,300-400 g,2-8℃,离心 5 min收集细胞;

3、按不同试剂公司说明取相应量的荧光染料标记结合溶液重悬细胞,浓度大约为(1~5)×106/mL;

4、按不同试剂公司说明向100 μL 细胞混悬液中加入适量的荧光标记的Annexin V染料,轻轻混匀后室温或 2-8℃ 避光条件下孵育5-15 min;

5、按不同试剂公司说明加入适量的核酸染料,轻轻混匀后室温或 2-8℃ 避光条件下孵育1-5 min;

6、加入 400μL PBS,轻轻混匀;

7、细胞过 200 目筛网后流式细胞仪检测;

结果说明:FITC-Annexin V/PE-Annexin V(-) PI/7-AAD(-)——活细胞;

FITC-Annexin V/PE-Annexin V(+) PI/7-AAD(-)——早期凋亡细胞;

FITC-Annexin V/PE-Annexin V(+) PI/7-AAD(+)——中晚期凋亡细胞。


注意事项


1、细胞处理要小心,尽量减少人为损伤,离心力在不损失细胞的情况下尽可能 小,重悬细胞要小心,避免多次吹打,不要涡旋;

2、荧光染料操作时要低温、避光;

3、含血小板的血液样品要去除血小板,因血小板含 PS,可与 Annexin V 结合干扰实验结果;  

4、流式细胞检测细胞量不得小于1×10^5

5、染色完成后过筛的单细胞悬液要尽快上机检测,缓冲液中细胞存活时间不常;    

6、 注意设置对照:空白对照 单染对照 阳性对照。


常见问题

1、实验中的诱导剂是否能产生凋亡,解决办法-确切的凋亡诱导剂设置阳性对照;


2、贴壁细胞消化不当,解决办法-无 EDTA 胰酶消化,Annexin V 与 PS 的结合依靠二价钙离子,EDTA 可螯合钙离子影响结合进而影响染色。


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