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病毒包装服务

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目前主流的病毒载体系统主要包括慢病毒(LV)、(γ-)逆转录病毒(RV)、腺病毒(Ad)和腺相关病毒(AAV)。


慢病毒(LV)和γ- 逆转录病毒(RV):均属于逆转录病毒科。其RNA基因组能逆转录为cDNA,稳定整合至宿主细胞基因组中。逆转录病毒通常分两种:γ- 逆转录病毒结构单一,慢病毒存在一些附属基因和调控基因,。


腺病毒(ADV):是一种复制缺陷型病毒,通过受体介导的内吞作用进入细胞,借助特定细胞系(HEK293)复制和增殖,不整合到宿主细胞基因组中。


腺相关病毒(AAV):属微小病毒科,为无包膜的单链线状 DNA 病毒。只有在腺病毒或者疱疹病毒等辅助病毒协助下,宿主才能产生具有感染性的AAV,所以 AAV 被称作腺相关病毒。

慢病毒载体( Lentiviral vector, LVs )是在 HIV-1 病毒基础上改造而成的病毒载体系统,它能高效的将目的基因(或 RNAi )导入动物和人的原代细胞或细胞系。慢病毒载体基因组是正链 RNA ,其基因组进入细胞质后,被自身携带的反转录酶反转录为DNA ,再进入到细胞核并整合到细胞基因组中。整合后的 DNA 转录 mRNA ,回到细胞质中,表达目的蛋白;或产生 RNAi 干扰。

慢病毒的优势


①      慢病毒能够感染多种难以感染的细胞,如原代细胞、干细胞、非分裂细胞(神经元细胞)等。


②      慢病毒能将外源基因整合到细胞基因组中,稳定表达外源基因。


③      慢病毒感染筛选稳定细胞株所需时间较短。


④      免疫原性低,安全性高。


•  慢病毒滴度(TU/ml)= 细胞数×103/病毒原液体积 (μl)


•  MOI=(病毒滴度×病毒体积)/细胞数目


Multiplicity of Infection(Mol), 感染复数,指每个细胞感染的病毒颗粒数,MOI越高,细胞越难感染。通常把某株细胞有80%被感染时的MOI值作为该株细胞的MOI。


Polybrene:带正电的小分子,与细胞表面阴离子结合能促进慢病毒对细胞的感染效率,通常能提高2~10倍,但有一定细胞毒性,浓度需摸索,一般在1~10μg/ml范围。


常见问题


1、在病毒感染时,不同的细胞建议先做预实验,设置MOI梯度,选择最适MOI进行正式实验


2、实际操作中,感染时是否加polybrene或稳株筛选时是否加嘌呤霉素可根据细胞状态而定,后续调整状态可适当提高血清浓度


3、如何测滴度?


在载体感染靶细胞之前,需要滴定产生的载体以调整载体的剂量。载体效价对评估转导效率也很关键。可以使用不同的方法完成滴定:(1)测量载体制剂中载体颗粒组分的量(物理颗粒数量/ p24 衣壳浓度/ RT 活性/基因组拷贝数); (2)测量感染细胞中的原病毒载体 DNA 拷贝数; (3)测量细胞中表达的转基因(通过流式细胞术或免疫染色)。


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