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分子生物学服务

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细胞或组织总蛋白提取与浓度测定(BCA法)

实验步骤

细胞或组织总蛋白提取与浓度测定

1 细胞总蛋白提取(冰上防止蛋白裂解)

1)吸去培养皿中的培养基,加入1 ml预冷PBS缓冲液洗3次。

2)加入适量含1×蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液(10 cm培养皿中一般加入500 μl,六孔板一般100微)。

3)冰上裂解15-30 min,将裂解后的细胞用细胞刮子刮下,吸入1.5ml离心管中。(这个裂解时间的长短有没有影响不清楚,本人之前刮细胞太慢,常常往后一个刮完后前面一个已经裂解了好久,可能都要一个小时了,应该问题不大)

4)在4℃条件下,12,000 rpm离心15 min,收集上清,即为细胞总蛋白。

2 小鼠组织总蛋白提取

1)取小鼠组织约50-200 mg,加入500 µl预冷的含1×蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液。

2)将小鼠组织剪碎,并用组织匀浆器匀浆。

3)冰上静置30 min。

4)在4℃条件下,12,000 rpm离心30 min。收集上清,即为组织总蛋白。

3 蛋白浓度测定(BCA法)

利用北京普利莱的BCA蛋白定量试剂盒(P1511)进行蛋白浓度测定,具体操作步骤如下:

1)将BCA蛋白定量试剂盒中的BCA Reagent和Cu Reagent按照50:1的比例配制成BCA工作液。

2)将4 mg/ml的BSA溶液倍比稀释,配置成浓度为4、2、1、0.5、0.25及0.125 mg/ml的BSA溶液作为蛋白标准品。

3)在96孔板中每孔加入100 µl BCA工作液,再加入5 µl蛋白样品或标准品,每个蛋白样品需设两个平行孔,充分混匀,注意尽量避免出现气泡,37℃孵育30 min。

以BCA溶液作为空白对照,使用酶标仪测定595nm处的吸光度值。通过酶标仪自带软件拟合曲线并计算每个样品的蛋白浓度。

RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)是一种传统的细胞组织裂解液。RIPA的本意是Radio Immunoprecipitation Assay。根据其裂解液的强度大致可以分为强、中、弱三类。(感觉这个总结不错)弱的裂解液适合做co-ip,如果是胞浆蛋白,对裂解液强度要求不高,如果是膜蛋白,要强裂解液。加了SDS裂解能力就比较强。


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