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一、细胞增殖

1.细胞增殖的定义

细胞以分裂的方式进行增殖。单细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的个体。多细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的细 胞，用来补充体内衰老或死亡的细胞。

2.细胞增殖的检测方法

① 细胞代谢活性检测

（基于MTT、CCK-8等）

MTT（噻唑蓝）：通过添加四咪唑盐到细胞中可进行线粒体内酶代谢活性的测定。活细胞能将四咪唑盐（如MTT、XTT、WST-1）还原成蓝紫色的甲瓒或甲瓒盐（Formazan），可通过分光光度计或酶标仪进行检测。

Cell Counting Kit–8 （CCK-8）中的WST-8被细胞内脱氢酶生物还原后生成的橙色甲臜染料能够溶解在组织培养 基中，生成的甲臜量与活细胞数量成正比。基于CCK-8（WST-8）的试剂盒能高度准确地检测细胞增殖，比MTT法 及XTT法的灵敏度高5倍，能检测更低的细胞数目。该试剂盒可适用于96孔板培养的贴壁或悬浮细胞。

② DNA的合成的检测

二.细胞自噬（Autophagy）

1、细胞自噬的定义

自噬（Autophagy）是普遍存在于真核细胞中的一种高度保守的代谢过程，是细胞内的一种“自食（Self-eating）”现象。它作为细胞内的主要降解途径，将胞内物质运输到溶酶体内降解。

它主要有三 种形式：大自噬，小自噬和分子伴侣介导的自噬。

细胞自噬检测方法

① 自噬标志物（ LC3）检测

自噬形成时，胞浆型 LC3（即 LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即 LC3-II），LC3-II/I 比值的大小可 估计自噬水平的高低。LC3 这一转变过程可被 Western Blot 和荧光显微镜检测到，现已成为监测自噬体形成的推荐方法。在哺 乳动物中，LC3 包含 3 种亚型：LC3A、LC3B、LC3C，分布在不同的组织中，因此需要用不同的抗体去鉴定这3种亚型。

② GFP-LC3 单荧光自噬指示体系

利用 LC3 在自噬形成过程中发生聚集的现象构建了 GFP-LC3 指示体系，无自噬时，GFP-LC3 融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成 时，GFP-LC3 融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通 过计数来评价自噬活性的高低。

③ mRFP-GFP-LC3 双荧光自噬指示体系

mRFP-GFP-LC3 融合蛋白的病毒产品 mRFP 用于标记及追踪 LC3，GFP 的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体。 由于 GFP 荧光蛋白对酸性敏感(pH 敏感)，当自噬体与溶酶体融合后 GFP 荧光发生淬灭,而 mRFP 相对稳定，因此只能检测到红色荧光。

要点：细胞凋亡、自噬和坏死的区别

凋亡：细胞皱缩、体积缩小；部分细胞器、核糖体和核碎片被细胞膜包裹形成 凋亡小体，从细胞表面出芽脱落，最 后被具有吞噬功能的细胞吞噬；磷脂酰丝 氨酸外翻；细胞核染色质浓缩、边缘化、染色质DNA断裂。

自噬：部分细胞器肿大，在细胞质中形成包裹细胞质内容物的双层膜囊泡结构 ，再与溶酶体结合实现内容物的降解。

坏死：细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢，DNA降解不充分 ，引起局部严重的炎症。

三、细胞迁移和侵袭

1、细胞迁移和侵袭的定义

①侵袭：肿瘤细胞向器官表面靠拢→肿瘤细胞用伪足贴在表面与内皮细胞粘连→肿瘤细胞用伪足从细胞的天然间隙 到达基底层→肿瘤细胞深入器官深部→形成癌巢搜索

②转移：肿瘤细胞离开原发瘤，侵入淋巴管（或血管）→肿瘤细胞在淋巴管（或血管）内运行→肿瘤细胞从管中出 来，再转移到其他淋巴结（或毛细血管）中→到达其他组织或器官

2、细胞迁移和侵袭的检测方法

① 细胞划痕检测细胞迁移

细胞划痕是一种简单易行的检测细胞运动的方法，实验成本低，可以用来检测贴壁生长肿瘤细胞的侵袭转移能力。 注意事项：一般做划痕实验，都是在无血清或者低血清状态下培养的，否则细胞增殖就不能忽略。

按照6孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形成若干交叉点，作为固定的检测点，这就解决了前后观察时位置不固 定的问题。

（基于BrdU的免疫法或EdU的点击化学法），可通过体内成像、微孔板或流式细胞术检测 等多种技术进行细胞示踪。

DNA的新组装合成是细胞生长的必要条件，故经常被用来进行细胞增殖、细胞活力及凋亡的检测。BrdU及EdU，都是胸腺嘧啶的非放射性类似物，能掺入增殖细胞的DNA中，可通过对BrdU及EdU的检测，从而对DNA的合 成量进行测定。

EdU（5-Ethynyl-2’- deoxyuridine）是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶（T）渗 入正在复制的DNA分子中，通过基于EdU与Apollo®荧光染料的特异性反应快速检测细胞DNA复制活性，适用于细 胞增殖、细胞分化、生长与发育、DNA修复、病毒复制、细胞标记示踪等方面的研究，尤其适合进行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他药物的筛选实验。

② Transwell检测细胞迁移和侵袭

细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸 酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞， 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研 究。侵袭实验需铺Matrigel，而迁移实验不需要。