杭州中康瑞源生物科技有限公司

  • 服务热线:4009097985
联系我们

联系方式:

地址:浙江省杭州市钱塘区下沙街道学林街1392号

热线:4009097985

电话:15350114126 (吴经理)

邮箱:1533423978@qq.com

网址:www.hzzkry.com



当前位置: 首页 - 实验服务

蛋白与抗体服务

咨询热线:4009097985

 

一、WB实验介绍


“Western Blot


WB(Western Blot,蛋白免疫印迹)是一种常规的蛋白分析技术,常用于鉴定某种蛋白,并能对蛋白进行定性和半定量分析。


WB实验的基本核心理念是抗原抗体的特异性反应,通过变性胶 SDS-PAGE 将不同分子量的蛋白质分离开,然后转移到固相载体 PVDF 膜上,再用脱脂牛奶作为封闭液进行封闭和一抗稀释液进行稀释。待目的蛋白和抗体充分结合后,用 TBST 洗脱液洗脱掉多余未结合的一抗,加入带有 HRP 标记的对应二抗,这样,我们的蛋白+一抗+二抗形成一个复合物,加以化学发光液,有靶蛋白的位置就会产生荧光,利用胶片或者化学发光仪就可以显现靶蛋白的条带显现。


WB常规实验流程:蛋白提取→蛋白定量→制胶→电泳→转膜→封闭→一抗孵育→一抗洗脱→二抗孵育→二抗洗脱→化学发光→数据分析。

二、WB实验试剂配置


在实验开始之前,可以按以下配方比例配置实验所需试剂。


1

电泳缓冲液

取电泳缓冲液干粉(G2018-1L),溶解于 1L纯水(G4701-500ML)中,置于磁力搅拌器(MS-150)上搅拌充分溶解。


2


转膜缓冲液

取转膜缓冲液干粉(G2017-1L),溶解于 800mL 纯水中,加入 200mL 的甲醇,置于磁力搅拌器上搅拌充分溶解。


3


TBST 缓冲液

取TBS 粉剂(G0001-2L),溶解于 2L 纯水中,加入 1mL 吐温20,置于磁力搅拌器上搅拌充分溶解。


4

5%脱脂牛奶


称量 5g脱脂奶粉(G5002-100G),溶解于 100mLTBST 溶液(G0004-500ML)中,置于磁力搅拌器上搅拌至少 30分钟,然后放入 4℃冰箱暂放。


5

完全裂解液


1mLRIPA 裂解液(G2002-100ML或G2033-100ML)+20μLcocktail(G2006-250UL)+10μL磷酸化蛋白酶抑制剂 A(G2007-1ML)+10μL磷酸化蛋白酶抑制剂 B(G2007-1ML)+10μLPMSF(G2008-1ML),除 RIPA 外,其他四种试剂使用前几分钟加入,现配现用。


三、WB实验步骤


由于文章篇幅限制,小赛这次先介绍组织或细胞的蛋白提取和蛋白定量常规流程。


蛋白提取


1 组织总蛋白提取


准备好所需要数量的样本管;放入研磨珠,置于冰盒上备用;


组织块先用预冷PBS洗涤 2-3 次,除去血污,然后放在滤纸上,吸尽多余的 PBS 后放入对应的匀浆管中,加入大约 10 倍样本体积的完全裂解液,置于组织研磨仪(三维冷冻研磨仪KZ-5F-3D)中,对称放置,确认放置平衡后,盖好盖子,选择程序开始匀浆。



Servicebio研磨仪


Tips


① 芝麻大小的组织,一般加入100-200μL 完全裂解液;绿豆大小组织加入 400-600μL 完全裂解液;黄豆大小组织加入 800-1000μL完全裂解液。


② Servicebio三维研磨仪参考参数:2mm 氧化锆珠8-12颗,频率6.5m/s,时间30s。如果一次匀浆不彻底,可以再次匀浆)。如果组织块比较大,可提前用剪刀将组织块剪碎。


2 悬浮细胞提取蛋白


将细胞连带培养基一起吸入15mL 离心管(EP-1501-J)中,4℃,2000rpm,离心 5分钟,去掉上清;


加入 1mLPBS 溶液(G4202-500ML)重悬细胞,将细胞转移到1.5mL 离心管(EP-150-M)中,然后 4℃,2000rpm,离心 5分钟,去掉上清,保留沉淀,重复此步骤 2-3 次(此步骤目的为清洗细胞中残留的培养基);


根据细胞沉淀的量加入适量的完全裂解液,例如沉淀体积为绿豆大小(大概 10uL 左右)的加入大约 200μL 完全裂解液,加入适量研磨珠,放入研磨仪进行裂解;


裂解完成后,12000rpm,4℃,离心 10分钟,上清即为总蛋白溶液。


3 贴壁细胞提取蛋白


倒掉培养基,沿细胞培养皿侧壁或者培养瓶瓶口慢慢加入 PBS 溶液,轻轻晃动平皿或者培养瓶,然后将细胞培养皿/瓶倾斜放置,用移液枪轻轻吸除残余液体,尽量轻柔,不要将细胞冲掉,清洗 2-3 次,最后一次将残余 PBS 完全吸干;


加入适当体积的完全裂解液(例如六孔板各单孔细胞长满的话,加入大约 250μL完全裂解液),反复晃动细胞培养皿/瓶,让裂解液与细胞完全接触,用细胞刮刀将细胞刮下来,收集后,加入研磨珠,放入研磨仪中进行裂解;


裂解完成后,12000rpm,4℃,离心 10分钟,上清即为总蛋白溶液。


蛋白定量


取适量上述步骤中未变性的总蛋白溶液,用BCA 蛋白定量检测试剂盒(G2026-200T;G2026-1000T)测蛋白浓度,蛋白浓度测定方法如下:配制蛋白标准贮备液


取1 mL蛋白标准配制液加入到蛋白标准品(BSA)蛋白标准管中,将25 mg蛋白标准品完全溶解,即得到浓度为25 mg/mL的蛋白标准贮备液。配制成的蛋白标准溶液可-20℃长期保存。



配制蛋白标准工作液


取适量25 mg/mL蛋白标准贮备液,用PBS或生理盐水稀释50倍,得到终浓度为0.5 mg/mL的蛋白标准工作液。注意稀释时按照10倍梯度方法稀释,确保稀释准确。

绘制标准曲线(酶标仪法)


将蛋白标准工作液分别按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到96孔板中,然后用PBS或生理盐水依次加20、19、18、16、12、8、4、0 μL将上述梯度工作液补足到20 μL。得到蛋白浓度依次为0、25、50、100、200、300、400、500 μg/mL的梯度曲线。

准备待测样品


将待测的蛋白样品进行适当稀释(可通过预实验检测,使样品蛋白浓度在标准曲线范围内,确保检测结果可信),按照每个样品20 μL的量加到96孔板中。待测样品与蛋白标准品用相同溶液稀释。

配制BCA显色工作液


将BCA试剂与硫酸铜溶液按照50:1体积比充分混合均匀,得到BCA显色工作液。BCA显色工作液可室温保存,24 h内使用。每个待测样品需200 μL,建议按需配制,避免浪费。



检测


向标准曲线样品孔及待测样品孔中每孔加入BCA显色工作液200 μL,充分混匀(可将96孔板放在振荡器上振荡30 s),37℃反应30 min后,以标准曲线0号做参比,在562 nm波长下比色测定,记录各孔吸光度值。(注:也可以在室温反应2 h,或60℃反应30 min。如果蛋白浓度较低,建议置于60℃反应)


计算

以标准曲线中梯度蛋白含量(μg/mL)为横坐标,吸光值为纵坐标,绘出标准曲线。根据所测样品的吸光值,在标准曲线上即可查得相应孔中待测样品的蛋白浓度(μg/mL),再乘以样品稀释倍数即为待测样品实际蛋白浓度。

 




上一篇:动物实验服务 下一篇:病毒包装服务

电话咨询

4009097985

添加咨询

添加咨询

添加咨询

添加咨询

添加咨询

添加咨询

添加咨询

添加咨询